Czystość peptydów: co oznacza „99 %” HPLC na certyfikacie i czego nie oznacza

HPLC — wysokosprawna chromatografia cieczowa — rozdziela składniki próbki poprzez przepychanie jej roztworu przez kolumnę wypełnioną pod ciśnieniem.

W HPLC fazy odwróconej, standardzie dla peptydów, wypełnienie kolumny jest niepolarne (zazwyczaj łańcuchy C18 związane z krzemionką), a faza ruchoma to woda z rosnącym udziałem acetonitrylu, zwykle z 0,1 % kwasu trifluorooctowego.

Składniki opuszczają kolumnę w różnym czasie w zależności od tego, jak mocno przylegają do wypełnienia: bardziej hydrofobowe — później.

Na wylocie detektor UV rejestruje absorbancję w funkcji czasu. Peptydy absorbują przy 214–220 nm z powodu wiązań peptydowych, dlatego stosuje się tę długość fali.

Zapis to chromatogram: linia bazowa z pikami, każdy pik odpowiada jednemu składnikowi, a jego powierzchnia jest proporcionalna do ilości tego składnika, który przeszedł przez detektor.

Wartość czystości to stosunek powierzchni:

czystość (%) = powierzchnia piku głównego ÷ suma powierzchni wszystkich pików × 100

Jeśli pik główny stanowi 99,2 % całkowitej zintegrowanej powierzchni, certyfikat podaje 99,2 %.

Wszystko inne na wykresie — 0,8 % — to piki zanieczyszczeń: inne cząsteczki absorbujące przy tej samej długości fali i eluujące w innych czasach.

Trzy szczegóły decydują o wartości tej liczby: laboratorium podało metodę (kolumna, gradient, długość fali), chromatogram jest pokazany z osiami, a integracja jest widoczna — które piki zostały policzone.

Wartość procentowa wydrukowana sama, bez wykresu, jest deklaracją, nie pomiarem.

Ogólny rozdział USP dotyczący chromatografii opisuje, co zawiera raportowalna metoda; poważny certyfikat jest z nim zgodny. Jak odczytać resztę dokumentu, opisano w jak odczytać COA peptydu.

Mówi: spośród materiału absorbującego UV, który opuścił kolumnę, 99 % eluowało jako pojedynczy pik. Próbka jest chromatograficznie czysta.

Nie mówi:

• Że fiolka zawiera 99 mg peptydu na 100 mg proszku. Liofilizowany peptyd nigdy nie jest czystym peptydem pod względem masy. Zawiera resztkową wodę (kilka procent), przeciwjony pozostałe po oczyszczaniu — octan lub trifluorooctan związany z resztami zasadowymi — i czasem sole. Żadne z nich nie absorbują przy 220 nm, więc nie pojawiają się na chromatogramie. Ułamek masowy właściwego peptydu to oddzielny pomiar nazywany zawartością netto peptydu, uzyskiwany przez analizę aminokwasową lub analizę elementarną (azotu), i zwykle wynosi 70–90 % dla peptydów liofilizowanych. Wartość 99 % HPLC i 80 % zawartości netto peptydu opisują tę samą fiolkę bez sprzeczności.
• Że pik główny to związek podany na etykiecie. Błędna sekwencja, dobrze oczyszczona, również daje jeden czysty pik. Tożsamość to inne pytanie, na które odpowiada spektrometria mas.
• Niczego o partii, którą posiadasz, chyba że certyfikat zawiera numer tej konkretnej partii.

Spektrometria mas waży cząsteczkę.

Próbka jest jonizowana (elektrosprej, ESI, lub MALDI), a przyrząd podaje stosunek masy do ładunku jonów; na tej podstawie laboratorium oblicza zaobserwowaną masę cząsteczkową i porównuje ją z teoretyczną masą związku.

Dla GHK-Cu oczekiwana masa wynosi około 404 Da; dla BPC-157 około 1 419 Da. Zgodność w granicach ułamka daltona potwierdza, że główny pik HPLC to peptyd podany na etykiecie.

HPLC bez MS daje czystość nieznanej substancji; MS bez HPLC daje tożsamość bez wartości czystości. Certyfikat analizy zawiera obie linie, z tej samej próbki, na tym samym raporcie.

Małe piki wokół piku głównego nie są tajemnicze. Synteza peptydów na fazie stałej i późniejsze postępowanie z produktem dają przewidywalny zestaw produktów ubocznych, z których każdy ma nazwę chemiczną:

• Sekwencje obcięte. Reszta nie uległa sprzężeniu podczas syntezy, więc część łańcuchów brakuje jednego aminokwasu (sekwencje delecyjne). Eluują blisko piku głównego i są najczęstszym zanieczyszczeniem.
• Łańcuchy niecałkowicie odbezpieczone. Grupa ochronna z syntezy (t-butyl, trityl) pozostała przyłączona. Nieco bardziej hydrofobowa: eluuje później.
• Deamidacja. Grupa amidowa łańcucha bocznego asparaginy lub glutaminy przekształciła się w kwas karboksylowy. Cięższa o jeden dalton; często widoczna jako ramię na piku głównym.
• Utlenianie metioniny. Siarka reszty metioniny przyłączyła tlen (sulfotlenek metioniny, +16 Da). Eluuje wcześniej. Semax zawiera metioninę, dlatego jest wysyłany szczelnie i w warunkach chłodniczych.
• Tworzenie aspartimidu i racemizacja. Przegrupowania przy resztach asparaginianu podczas syntezy; drobne, ale charakterystyczne.
• Dimery i agregaty. Dwa łańcuchy połączone, zwykle przez cysteinę; znacznie późniejsza elucja i podwojona masa na MS.

Laboratorium, które raportuje te piki z nazwą lub przynajmniej czasem retencji i powierzchnią, pokazuje swoją integrację. Laboratorium, które pokazuje tylko jedną liczbę, tego nie robi.

Fraza pojawia się w tysiącach ofert. Dosłownie jest specyfikacją — „zamierzamy uzyskać co najmniej 98 %” — nie pomiarem żadnej partii.

Bez wykresu, metody i numeru partii nie można jej zweryfikować, a wartość, której nie można zweryfikować, ma taką samą wartość informacyjną jak brak wartości.

To samo dotyczy wartości procentowych podawanych bez miejsca po przecinku dla każdego produktu dostawcy.

Wartości zmierzone wynoszą 98,7 % lub 99,31 %; katalog, w którym każda pozycja podaje „99 %”, został wpisany, nie przetestowany.

Kontrole dostawców wynikające z tego opisano w jak sprawdzić dostawcę peptydów.

Przypadek, w którym linia masy, a nie wartość procentowa, stanowi całą kontrolę tożsamości, omówiono w GHK-Cu vs AHK-Cu, dwóch związkach różniących się o 14 Da.

Przykład opracowanego certyfikatu dla pojedynczego związku — rozmiary, partia, co pokazuje raport — znajduje się w poradniku zakupu BPC-157.